(Назад)
(Cкачать работу)імунопреципітованих з клітин НЕК293, трансфікованих відповідними ДНК конструкціями, виявив 2-3 разове зростання активності як S6K1, так і S6K2 стосовно рівня фосфорилювання рибосомного білка S6 (рис. 3).
Поряд із цим, заміна Thr252Asp у S6K1 та Тhr241Asp у S6K2 призводила до протилежного ефекту, а саме - повного інгібування активності щодо фосфорилювання S6 рибосомного білка. Одночасна мутація обох регуляторних сайтів фосфорилювання (S6K1Т412D/Т252D та S6K2Т401D/Т241D) не відновлювала активності мутантних форм кіназ.
Отримані результати свідчать, що фосфорилювання Thr401 у S6K2 аналогічно фосфорилюванню Thr401 у S6K1 є важливим для активації кіназ.
Приймаючи до уваги дані літератури, щодо ключової ролі фосфорилювання Thr252, розташованого в каталітичному домені S6K1, для остаточної активації S6K1 (Thomas, 2002), представлені дані вказують, що Thr241 у S6K2 є також функціонально необхідним для прояву кіназної активності.
Мутаційний аналіз залишку Lys123 у S6K1, що, як відомо, входить до каталітичного сайта S6K1 і залучений до зв’язування з АТР (Thomas et al., 1998), і Lys 112 у S6K2 вказує на те, що Lys 112 є критичним для функціонування каталітичного домену S6K2 також. Згідно наведених даних його заміна на Arg, як і у випадку S6K1, призводить до інактивації S6K2 у реакції фосфорилювання S6 рибосомного білка (рис. 3).
Роль мітогенних факторів в регуляції активності S6K1 та S6K2. Згідно з даними літератури, S6K1 активується у відповідь на стимуляцію клітин різними ростовими факторами, зокрема, епідермальним фактором росту (EGF), фактором росту з тромбоцитів (PDGF), інсуліном та сироваткою (Chou and Blenis, 1995). Встановлено також опосередковану інтегринами активацію S6K1 у клітинах макрофагів лінії P388D1 та фібробластах REF52, індуковану взаємодією клітин з фібронектином чи ламініном (Wei et al., 1998).
Порівняння динаміки активації S6K1 та S6K2 у відповідь на стимуляцію клітин НЕК293 сироваткою свідчить про двофазовий характер активації обох кіназ (рис. 4), однак кінетика активації S6K1 і S6K2 суттєво відрізнялися. На відміну від S6K1, активація S6K2 відбувається значно швидше. Крім того, другий пік активності S6K2 збігався у часі з першою стадією інактивації S6K1, що вказує на різний за часом прояв їхньої функціональної активності у відповідь на стимулювання мітогенами і можливу функціональну відмінність кіназ.
У разі опосередкованої інтегринами активації максимальний рівень активності для обох форм S6К припадав на 90-ту хв після стимуляції клітин фібронектином і характеризувався 3,5-4-кратним зростанням кіназної активності (рис. 5). Однак для S6K2 характерним є існування додаткового піка активації з максимумом на 40-й хв, фази інактивації впродовж наступних 20 хв і піка активації, що збігається з єдиним піком активації S6K1. Як і при активації кіназ сироваткою, кінетика активації S6K1 має більш уповільнений характер.
Таким чином, виявлені відмінності в активації S6K1 та S6K2 свідчать про здатність S6K2 забезпечувати ранню відповідь клітин на дію позаклітинних стимулів, у той час як S6K1, скоріш за все, забезпечує більш пізню стадію регуляції фосфорилюванння S6 білка. Можливість існування диференційних механізмів модуляції сигнальних шляхів, які опосередковують регуляцію S6K1 та S6K2, було надалі досліджено з використанням специфічних інгібіторів mTOR та РІ3K – рапаміцину та вортманіну відповідно.
Визначення ролі РІ3К/mTOR-залежного
Похожие работы
Интересная статья: Основы написания курсовой работы