Читать реферат по финансовому менеджменту, финансовой математике: "Техника жидкостной, колоночной хроматографии" Страница 5

(Назад) (Cкачать работу)

Этот ролик силою трения заставляет вращаться все периферийные ролики так, что они без всякого скольжения катятся по резиновой трубке. (Степень их прижатия к резине и здесь регулируется винтом.) Однако в этой системе длительная эксплуатация прибора тоже приводит к износу. Но не резины, а самих роликов, изготавливаемых из тефлона. Что нарушает их сцепление с центральным роликом.

Создание градиента концентрации CsCI

Отмеченная ранее малая вязкость солевых растворов имеет ту оборотную сторону, что она не позволяет заранее (как это делают для растворов сахарозы) создавать в центрифужной пробирке градиент концентрации соли. Этот градиент очень быстро будет разрушен за счет диффузии ионов соли. Зато, ввиду тяжести молекулы CsCI, при длительном и неизменном по скорости вращении первоначально однородного раствора соли устанавливается динамическое равновесие между седиментацией самих молекул соли и их диффузией. В результате образуется (в ходе самого центрифугирования!) некий, нелинейный градиент концентрации CsCI, a следовательно, и плотности его раствора по высоте пробирки. Вполне пригодный для фракционирования биологических макромолекул или частиц по их плавучей плотности.

Установление градиента плотности раствора CsCI в ходе центрифугирования — процесс долгий. Он занимает, как минимум, 60—70 часов. Его можно несколько ускорить, если предварительно заполнить пробирку тремя равными порциями растворов CsCI различной плотности: средней для среднего слоя заполненной пробирки и, соответственно, увеличенной или уменьшенной на половину от величины различия плотностей, которые ожидают получить для жидкой среды центрифугирования у дна пробирки и на ее мениске.

С этой же целью равновесное ультрацентрифугирование проводят иногда в угловых роторах. Распределение плотностей раствора CsCI во время центрифугирования идет все равно в направлении радиуса вращения, но значительно быстрее, поскольку в этом направлении наклонно стоящая пробирка намного короче (см. рис. 48а). На том же рисунке условно-дискретными зонами показано расположение слоев различной плотности CsCI к концу центрифугирования (различная штриховка) и находящиеся

Рис. 48

между ними полосы разделившихся частиц (жирными линиями на рис. 486). Положение этих зон и полос в пробирке, извлеченной из ротора по окончании центрифугирования показано на рис. 48 в. В течение некоторого времени, пока диффузия не размоет эту картину, раздельное положение полос вещества сохраняется.

В качестве примера приведу результат очистки равновесным центрифугированием плазмид от примеси основной массы ДНК бактерии (Currier, Nester, 1976). Основную массу ДНК бактерии — хозяина удаляли денатурацией при рН12,2 и переводом ее в фенольную интерфазу в присутствии 0,5 М NaCI (см. гл. 3, § 2). Плазмидная ДНК оставалась в водной фазе, где она легко ренатурируется. Дальнейшую ее очистку вели равновесным центрифугированием в CsCI с добавлением бромистого этидия для окраски полос. Использовали 48% -ный раствор CsCI, чему соответствовала его начальная плотность 1,55 г/см3. (Столь малое значение этой плотности обусловлено уменьшением плавучей плотности ДНК обоих типов за счет

Похожие работы